Methoden der AG Molekulare Neurowissenschaften

Patch-Clamp [Whole-Cell und Single-Channel recording]

Mithilfe elektrophysiologischer Methoden können biophysikalische und pharmakologische Eigenschaften von Ionenkanälen und Rezeptoren funktional charakterisiert und Signalwege untersucht werden.

Laserscanning-Mikroskopie, Visualisierung der aktivitätsabhängigen Translokation von fluoreszenzmarkierten Proteinen, FRET, FRAP, TIRF, Ca2+-Imaging

Hochauflösende Laserscanning Mikroskopie wird verwendet, um die Lokalisation markierter Proteine (Rezeptoren, Ionenkanäle, G-Proteine und deren Interaktionspartner) in zellulären und subzellulären Strukturen zu untersuchen. Die hochauflösende Analyse der räumlich/zeitlichen Dynamik aktivitätsabhängiger Translokation von fluoreszenzmarkierten Proteinen kann zur Aufklärung beteiligter Signalwege und Signalisierungsmechanismen beitragen.

Mithilfe von FRET und FRAP können direkte Protein/Protein Interaktionen analysiert werden. FRET nutzt dabei die räumliche Nähe interagierender Proteine, während FRAP die Mobilität der Interaktionspartner untersucht.

TIRF Mikroskopie bietet die Möglichkeit membrannah lokalisierte fluoreszenzmarkierte Proteine mit hoher räumlicher Auflösung zu untersuchen. Die Translokation markierter Interaktionspartner zur oder von der Plasmamembran kann in hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung visualisiert werden.

Ca2+ Imaging Experimente ermöglichen die Messung der intrazellulären Ca2+ Ionen Konzentration und deren zeitliche Änderung. Die Messungen können je nach Bedarf und Objekt in Zellkultur oder Gewebeschnitten erfolgen und Signalwege entlang nativer oder rekombinanter Ionenkanäle betreffen.

Mithilfe pharmakologischer Werkzeuge (spezifische Agonisten und Antagonisten, Aktivatoren und Inhibitoren, Kanalblocker) werden die funktionalen Eigenschaften von Ionenkanälen und Rezeptoren charakterisiert und die involvierten Signalwege identifiziert und analysiert.

Die Wirkung endogener oder synthetischer Wirksubstanzen (etablierte und neuartige Drugs) auf Ionenkanäle, Rezeptoren und Signalwege in einzelnen Zellen oder komplexen Netzwerken kann mit Hilfe elektrophysiologischer und bildgebender Verfahren analysiert werden.

Molekular- und zellbiologische Methoden (Klonierung, Subklonierung, Mutagenese, Zellkultur, viraler Gentransfer [rekombinante Adenoviren], transneuronales Tracing [rekombinante Pseudorabies Viren])

Die Kultur primärer Zellen und etablierter Zelllinien erlaubt die Untersuchung nativer Rezeptoren, Ionenkanäle und Signalwege, sowie rekombinanter Proteine in heterologen Expressionssystemen. Die Klonierung von Zielgenen und die Expression der Proteine ermöglicht die gezielte Analyse molekularer und funktionaler Eigenschaften in definierten Systemen. Ein Vergleich wild-typischer Proteine mit Rezeptoren oder Ionenkanälen die definierte Mutationen enthalten, ermöglicht die Untersuchung von Struktur/Wirkungs-Beziehungen und die Analyse funktionaler Domänen.

Der Einsatz von rekombinanten Viren erlaubt die gezielte Transformation von Zellen und Geweben, die mit herkömmlichen Methoden nicht, oder nur unzureichend erreicht oder transfiziert werden können. Die Bedeutung einzelner Proteine für native Zellen kann durch RNAi vermittelten knock-down überprüft werden.

Die Untersuchung von Zell/Zell-Verbindungen und Projektionsbahnen kann in transneuronalen tracing-Studien untersucht werden.

Mit immunzytochemischen Methoden (in Kombination mit hochauflösender Mikroskopie) werden die Expression und Lokalisation von Zielproteinen in Geweben, Zellen und subzellulären Strukturen untersucht.

Proteinbiochemische Methoden (Aufreinigung, Chromatographie, Elektrophorese, Massenspektrometrie, Sequenzierung) können zur Analyse einer gewebe- und zellspezifischen Proteinexpression eingesetzt werden und ermöglichen die Identifizierung der target-Proteine und möglicher Interaktionspartner.

Mithilfe chip-basierter Transkriptomanalysen und Hochdurchsatz-DNS-Sequenzierung sollen gewebs-, funktions- und krankheitsspezifische Expressionsmuster auch an Patientenmaterial (Blutzellen, Zellen der Nasenschleimhaut, Fibroblasten) untersucht sowie molekulargenetische Grundlagen von Krankheitsbildern identifiziert und analysiert werden. Identifizierte Proteine sollen dann funktional charakterisiert und somit das Verständnis ihrer Bedeutung für die Pathologie vertieft werden.